Иммунобиохимические особенности тимуса при миастении

В.Б. Ланцова, Е.К. Сепп

Myasthenia Gravis – аутоиммунное заболевание, при котором вырабатываются антитела (АТ) к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам (нАХР) постсинаптической мембраны мышц, вследствие чего нарушается прохождение импульса от нервной клетки к мышечной. Клиническим проявлением такой аутоиммунной агрессии является слабость произвольной мускулатуры с патологической мышечной утомляемостью. Среди большого спектра аутоиммунных болезней миастения занимает особое место, так как механизмы ее развития неизмеримо более интимно связаны с патологическими изменениями в тимусе, которые встречаются у 60% пациентов [2, 34].

Ни при одном другом аутоиммунном заболевании удаление вилочковой железы не дает такого высокого процента положительных результатов (улучшение или выздоровление), как при миастении (от 60 до 80%, по данным разных авторов) [2, 7, 22]. Ряд авторов [9, 33, 34] разделяет больных миастенией по виду патологии тимуса (тимома, гиперплазия, атрофия), возрасту начала заболевания и HLA ассоциации.

Примерно в 9-16 % наблюдений генерализованная миастения сочетается с тимомами - наиболее часто встречающимися новообразованиями переднего средостения [2, 11, 22]. Гиперплазия вилочковой железы чаще встречается у женщин моложе 40 лет и эффективность тимэктомии в этой группе больных может достигать 100% [4]. Гиперплазия характеризуется гиперпродукцией тимических гормонов, снижением процентного содержания Т–лимфоцитов, повышением абсолютного числа «О» и В–лимфоцитов, спонтанной реакцией бласттрансформации лимфоцитов, а также относительным преобладанием хелперной над супрессорной активностью Т–лимфоцитов. Для пациентов этой группы характерно повышение IgG, в меньшей степени - IgA, узкий спектр при высоком титре антител (в 80-90% это антитела к нАХР, у 50% пациентов - и к другим антигенам), HLA ассоциация - В8, DR3, преобладание поражения 1, 3 и 4 региона АХР [10, 33, 34].

При атрофии тимуса иммуногистохимические исследования показывают резкое уменьшение продукции тимических гормонов, достоверное снижение активности Т–супрессоров и уменьшение продукции иммуноглобулинов А и G. Характерна HLA ассоциация А2, В7, DR2, при невысоком титре антител к АХР с поражением 1 и 4 его регионов [10]. Атрофия тимуса встречается преимущественно у пациентов мужского пола старше 40 лет. В этой группе больных тимэктомия неэффективна в 58% случаев [4]. Тимомы по клеточному составу подразделяются на доброкачественные и злокачественные. Не существует определенной HLA ассоциации у больных миастенией при наличии тимомы [9]. Антитела в крови больных с тимомой, имеющих миастению и без нее, представлены широким спектром АТ к различным структурам мышечной ткани [10, 17, 28]. Возраст начала заболевания в этой группе колеблется от 30 до 60 лет. Эффективность оперативного лечения у больных миастенией с тимомами оценивается по двум параметрам: наличие или отсутствие рецидивов опухоли и характер течения миастенического процесса после тимомтимэктомии.

АНТИГЕННЫЕ БЕЛКИ ТИМУСА.

Многообразие функций тимуса в человеческом организме отражается в богатстве его молекулярных структур. Лишь некоторые из них локализованы, установлена их химическая структура и биологическая активность. Среди антигенных белков, участвующих в аутоиммунном процессе при миастении и локализованных в тимусе, идентифицированы: никотиновые ацетилхолиновые рецепторы [18], клеточные рецепторы для антител FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) [31], белки, принадлежащие к семейству онкогенов [13] и адгезинов [14], Fas антигены и их лиганды [20], нейроэндокринные маркеры [23], а также titin - белки [6] и рианодиновые рецепторы (RyR) скелетных мышц [24].

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор. На начальных этапах изучения роли вилочковой железы при миастении в культуре тимусной ткани больных были обнаружены клетки, несущие рецепторы к ацетилхолину (АХ), которые являются первичными АГ, индуцирующими аутоиммунную реакцию против мышечных нАХР [11]. Использование поликлональных и моноклональных АТ помогло выявить те участки полипептидов, которые ответственны за связывание АХ (или токсина), а также участки, формирующие собственно канал и позволяющие расширить имеющиеся представления о патогенетических механизмах при нарушении нервно-мышечной передачи. В частности, установлено, что АТ к нАХР направлены к разным субъединицам [28] и разным участкам субъединиц, которые находятся в разных местах молекулы рецептора [34].

Дальнейшие работы были направлены на более детальное изучение локализации, строения и функций нАХР. Так, было установлено [26], что эпителиально-клеточные опухоли тимуса, ассоциированные с миастенией, экспрессируют эпитоп цитоплазматической части нАХР α 373-380. Предполагалось, что сенсибилизация к этому эпитопу являлась пусковой для аутоиммунной реакции против нАХР у пациентов с тимомзависимой миастенией. Применяя иммуногистохимические методы, Kawanami S. с соавторами [19] установили локализацию Fas антигена и нАХР в эпителиальных клетках телец Гассаля и подкапсулярных эпителиальных клетках тимуса больных миастенией и в тимомах.

Продолжая начатые исследования [20], авторы выделили нАХР и Fas антиген из экстракта кортикальной тимомы больных миастенией. В неопластических эпителиальных клетках тимуса методом иммуноблоттинга были определены оба антигена. Была установлена гомология аминокислотной последовательности нАХР и Fas антигена в следующих участках: α 316-355 θ Fas 232-271, γ 321-352 θ Fas 3-34. На основании этих исследований авторы полагают, что эти два антигена могут играть пусковую роль в возникновении аутоиммунной реакции.

Нами было проведено исследование [3] антигенных белков тимуса (при его гиперплазии, атрофии и опухолевой трансформации) с помощью поликлональных антител к коротким пептидам, которые аналогичны некоторым участкам нейрональных субъединиц АХР: α4 (375-404) и α7(7-30), α7(322-338), β2(34-50) а также α1(1-209) субъединицы мышечного нАХР. При иммуноблоттинговом исследовании только в белковой смеси, выделенной из ткани тимомы, идентифицированы три окрашенных белковых полосы с м.в. 14, 12 и 10 кДа, которые связывают антитела к цитоплазматическому участку α4 субъединицы нейронального АХР, что может быть отражением многообразия антигенных структур опухолевого тимуса.

Рианодиновый рецептор(RyR). Сравнительно недавно были открыты другие антигенные молекулы, к которым относятся RyR кальций высвобождающих каналов саркоплазматического ретикулума. Эти рецепторы относятся к хемовозбудимым каналам, лигандом которых является кофеин. Роль рианодиновых рецепторов в качестве антигенных структур в настоящее время интенсивно исследуется, и появление у больных миастенией с тимомой АТ к RyR рассматривается рядом авторов как признак злокачественного течения миастенического процесса [21, 24]. Fas антигены способны ингибировать или активировать запрограммированную гибель клеток (апоптоз).

В работах последних лет имеются сведения об обнаружении антител у больных миастенией в сочетании с тимомой к RyR скелетных мышц [21], титр которых коррелирует с проявлениями болезни и смертностью. Уровень RyR антител положительно коррелировал с тяжестью миастенического процесса [32]. Рианодиновые рецепторы кальциевых каналов участвуют в механизме сокращения поперечно-полосатой мышцы. В работе Mygland A. с соавторами [25] тимома была исследована с панелью поликлональных кроличьих антител против различных коротких пептидов RyR. Антитела связывались с пептидом С2 трансмембранного участка RyR, присутствовавшего в тимомных эпителиальных клетках. При этом С2 RyR антитела не взаимодействовали с нормальным тимусом, миндалинами и карциномой толстой кишки.

Экспериментально изучением рианодиновых рецепторов на спонтанно возникающих тимомах у крыс линии Buffalo занимались Iwasa K. с соавторами [16], которые подтверждают, что причиной мышечной слабости в эксперименте являются анти-RyR антитела. Интересно отметить, что антитела к нАХР в сыворотке крови животных отсутствовали, поэтому мышечная слабость обусловлена именно RyR антителами. Антионкогены. Наиболее интересные результаты получены при исследовании экспрессии генов, способных ингибировать или активировать запрограммированную гибель клеток, например, bcl-2, c-mys, p53 гены, а также гены комплекса Fas-лиганд/Fas антиген, которые принимают участие в регуляции клеточного роста. Установлено, что bcl-2 белок (М.м. 25-26 кД) действует как антиоксидант, ингибируя развитие апоптоза, вызванного перекисью водорода или истощением запасов глутатиона [12].

Недостаточная информативность морфологических критериев диагностики инвазивных, неинвазивных и злокачественных тимом привела к поиску других методов их дифференцировки, основанных на идентификации факторов, действующих как супрессоры клеточной пролиферации. Эти факторы могут контролировать рост нормальных клеток и участвовать в процессе клеточной трансформации. В работе Chen F.F. с соавторами [8] иммуногистохимическим методом была исследована экспрессия белков bcl-2 и p53 эпителиальными клетками тимуса. Высокая экспрессия белка bcl-2 наблюдалась при карциномах тимуса и тимомах в сочетании с миастенией. Появление в клетках белка p53 не коррелировало с гистологическим типом и тяжестью миастенического процесса, тогда как обнаружение в клетках вилочковой железы Bcl-2 свидетельствовало об агрессивности тимических эпителиальных опухолей. В то же время Onodera J. с соавторами [29], изучая экспрессию Fas антигена и Bcl-2 протеина в гиперплазированном и опухолевом тимусе, обнаружили, что Fas антиген локализуется, главным образом, в эпителиальных клетках медуллярной части тимуса, в то время как Bcl-2 протеин был высоко экспрессирован в медуллярных тимоцитах при гиперплазии, и очень низко - в тимомах.

Авторы предполагают, что Bcl-2 протеин можно рассматривать как регулятор процессов, происходящих в тимусе при миастении, через механизм апоптоза аутореактивных тимоцитов. Неспецифичные по отношению к иммунному ответу белки. Кроме этих белковых антигенных молекул, имеющих большое значение, при миастении были определены и другие белки. Считается, что они неспецифичны по отношению к иммунному ответу, хотя помогают его формированию, организуя миграцию клеток или усиливая межклеточные контакты в процессе распознавания антигена. Молекулы клеточной адгезии – связанные с плазматической мембраной белки, которые обеспечивают механическое взаимодействие клеток друг с другом.

Изучение этих белков при тимомах имеет огромное значение, так как изменение количества этих молекул связывают с метастазированием, а повышение плотности адгезивных молекул индуцирует внутриклеточные метаболические реакции. Коллектин–1 относится к семейству кальцийзависимых лектинов (коллагеновых лектинов). Он синтезируется эпителиальными клетками в миастеническом тимусе при его гиперлазии и опухолевом перерождении, а также в тимусе детей. Этот белок играет большую роль в межклеточных взаимодействиях при миастении [14]. Относимые к классу молекул клеточной адгезии Е – кадгерин (Е-CD) и α– и β-катенины были обнаружены в кортикально-клеточных тимомах. В смешанно-клеточных и медуллярных тимомах эти белки не выявляются.

Кроме этого, было установлено, что наличие этих молекул скрыто ассоциировано с гистологическим субтипом тимом и что экспрессия этих молекул не коррелирует с инвазивностью и началом миастении [30]. До настоящего времени практически не изучен вопрос о механизме возможного участия системы гамма – глутамилтранспептидазы (γ-ГГТ) в иммунологических реакциях. Универсальная роль γ-ГГТ в таких ключевых процессах поддержания гомеостаза, как обмен глутатиона и аминокислот, не исключает функциональной органоспецифичности фермента.

Предполагается, что локализованная в лимфоцитах γ-ГГТ может обусловливать их поверхностные иммунологические свойства [5]. Имеются сообщения об обнаружении фермента на поверхности Т- и В-лимфоцитов периферической крови, причем в норме активность γ-ГГТ преобладает в субфракции В-клеток [27]. Нами было показано [3], что наиболее значимое изменение активности γ – ГТП наблюдается у больных с тимомами, которая была повышена в опухолевой ткани в 56.5 раз, а в окружающей – в 10.6 раза. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, предполагающих, что тимомы в процессе роста интенсивно используют глутатион [5]. Кроме этого, будучи сиалопротеидами по природе, субъединицы γ-ГТП в определенных условиях, вероятно, могут образовывать лиганды с белками или обрывками пептидов и служить собственно антигенами или способствовать антигенообразованию.

Суммируя вышеизложенное, можно предположить причастность ферментной системы γ-ГГТ к регуляции иммунологической реактивности организма. Так, являясь гликопротеидом, фермент, локализованный с субпопуляциях Т- и В-лимфоцитов, может выполнять роль иммуномодулятора на клеточном уровне. В частности, сиаловый компонент молекулы γ-ГГТ на поверхности Т-хелперов и Т-киллеров может обеспечивать процесс «узнавания» антигенов и определять мощность киллерной активности и продуктивность антителообразования. Таким образом, несмотря на продолжительность и масштабность изучения антигенных белков тимуса и большой фактический материал, вопросы происхождения, биологической роли и механизма их действия попрежнему остаются нераскрытыми и требуют дальнейшего изучения.

ЛИТЕРАТУРА

Короткина Р.Н., Мацкевич Г.Н., Панова Н.В., Карелин А.А., Вишневский А.А. Исследование ферментов обмена глутатиона в злокачественных новообразованиях легких и вилочковой железы // Российский онкологический журнал. – 1999. – № 2. – С. 44-48.
Кузин М.И., Гехт Б.М. Миастения. М. – Медицина. – 1996. – 215 с.
Ланцова В.Б., Сепп Е.К. Особенности белков тимуса при миастении (иммунно-биохимическое исследование) / В кн. Научные труды сотрудников ЦКБ МПС РФ // М.: – 2001. – Т. 6. – С. 266-275.
Харченко В.П., Саркисов Д.С., Ветшев П.С., Галил-Оглы Г.А., Зайратьянц О.В. Болезни вилочковой железы // М. – 1998. – «Триада-Х». – 232 c.
Чернобровкина Т.В. Энзимопатии при алкоголизме // К.: Здоровья. – 1992. – 312 с.
Berrih-Aknin S., Morel E., Raimond F. et al. The role of the thymus in Myasthenia Gravis. In: Myasthenia Gravis: biology and treatment // Ed.D.Drachman / Ann. N.Y.Acad.Sci. – 1987. – P. 50-70
Buckingham J. M., Howard F.M. et al. The value of thymectomy in myasthenia gravis: a computer – assisted matched study // Ann. Surg. - 1976. – Vol. 184. – P. 453-457.
Chen F.F., Yan J.J., Jin Y.T., Su I.J. Detection of bcl-2 and p53 in thymoma: expression of bcl-2 as a reliable marker of tumor aggressiveness // Hum. Pathol. – 1996. – Vol. 27. – № 10. – P. 1089-1092
Compston D.A.S., Vinsent A., Newsom-Davis J., Batchelor J.R. Clinical pathological HLA antigen and immunological evidence for disease heterogeneity in myasthenia gravis // Brain. – 1980. – Vol. 103. – P. 579-601
Drachman D. Myasthenia Gravis: biology and treatment // Ed. D.Drachman / Ann. N.Y.Acad. Sci. – 1987. – P. 718-724.
Eymard B., Berrih-Aknin S. Role of the thymus in the physiopathology of myasthenia // Rev. Neurol. (Paris). – 1995. – Vol. 151. – P. 6-15.
Fawthrop D.J., Boobis A.R., Davies D.S. Mechanisms of cell death // Arch. Toxicol. – 1991. – Vol. 65. – P. 437-444.
Gilhus N.E., Jones M., Turley H., Gatter K.C., Nagvekar N., Newsom-Davis J., Willcox N. Oncogene proteins and proliferation antigens in thymomas: increased expression of epidermal growth factor receptor and Ki67 antigen // J. Clin. Pathol. – 1995. – Vol. 48. – № 5. – P. 447-455.
Hafer-Macko C., Pang M., Seilhamer J.J., Baum L.G. Calectin-1 is expressed by thymic epithelial cells in myasthenia gravis // J. Glycoconj. - 1996. – Vol. 13. – № 4. – P. 591-597.
Hohlfeld R., Wekerle H. The role of the thymus in myasthenia gravis // Adv. Neuroimmunol. – 1994. – Vol. 4. – P. 373-386.
Iwasa K., Komai K., Takamori M. Spontaneous thymoma rat as a model for myasthenic weakness caused by anti-ryanodine receptor antibodies // Muscle & Nerve. – 1998. – Vol. 21. – № 12. – P. 1655 -1660.
Janossy G., Bofill M., Tredosiewicz L. et al. Cellular differentiation of lymfoid subpopulations and their microinviron. The Human Thymus // Ed. H.Muller-Hermellink. – 1986. – P. 89-127.
Kaminski H.J., Fenstermaker R.A., Abdul-Karim F.W. et al. Acetylcholine receptor subunit gene expression in thymic tissue // Muscle & Nerve. – 1993. – Vol. 16. – P. 1332-1337.
Kawanami S., Mori S., Kikuchi M., Shirakusa T. Fas and nicotinic acetylcholine receptor in human myasthenic thymus –immunohistochemical study // Fukuoka Igaku Zasshi. – 1999. – Vol. 90. – № 6. – P. 286-294.
Kawanami S, Mori S, Ueda H. Homology between Fas and nicotinic acetylcholine receptor protein in a thymoma with myasthenia gravis – immunohistochemical and biochemical study // Fukuoka Idaku Zasshi. – 2000. – Vol. 91. – № 5. – P. 123-131.
Kusner L.L., Mygland A., Kaminski H.J. Ryanodine receptor gene expression thymomas // Muscle & Nerve. – 1998. – Vol. 21. – P. 1299-1303.
Lisak R. Myasthenia Gravis. I: Surgery of the thymus // Ed. J.-C.Givel. – Berlin / Springer Verlang. – 1990. – P. 165-181.
Marie J., Wakkach A., Coudray A., Chastre E., Berrih Aknin S., Gespach C. Functional expression of receptors for calcitonin generelated peptide, calcitonin, and vasoactive intestinal peptide in the human thymus and thymomas from myasthenia gravis patients // J. Immunol. – 1999. – Vol. 162. – № 4. – P. 2103-2112.
Mygland A., Aarli J.A., Matre R., Gilhus N.E. Ryanodine receptor antibodies related to severity of thymoma associated myasthenia gravis // J. Neurol., Neurosurg., Psychiat. – 1994 – Vol. 57. – P. 843-846.
Mygland A., Kuwajima G., Mikoshiba K., Tysnes O.B., Aarli J.A., Gilhus N.E. Thymomas express epitopes shared by the ryanodine receptor // J. Neuroimmunol. – 1995. – Vol. 62. – P. 79-83.
Nagvekar N., Jacobson LW., Willcox N., Vincent A. Epitopes expressed in myasthenia gravis (MG) thymomas are not recognized by patients' T cells or autoantibodies // Clin. Exp. Immunol. – 1998. – Vol. 112. – P. 17-20.
Novogrodsky A., Tate E.S., Meister A. г- glutamyltranspeptidaze, a lymphoid cell surface marker: relationship to blastogenesis, differentiation and neoplasia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1976. – Vol. 73. – №7. – P. 2414-2418.
Oda K. Differences in acetylcholine receptor antibody interactions between extraocular and extremity muscle fiber // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1993. – Vol. 681. – P. 238–255.
Onodera J, Nakamura S, Nagano I, Tobita M, Yoshioka M, Takeda A, Oouchi M, Itoyama Y. Upregulation of Bcl-2 protein in the myasthenic thymus //Ann. Neurol. – 1996. – Vol. 39. – P. 521-528.
Pan C.C., Ho D.M., Chen W.Y., Chiang H., Fahn H.J., Wang L.S. Expression of E-Cadherin and alpha- and beta-catenins in thymoma // J. Pathol. – 1998. – Vol. 184. – P. 207-211.
Raknes G., Skeie G.O., Gilhus N.E., Aadland S., Vedeler C. FcgammaRIIA and FcgammaRIIIB polymorphisms in myasthenia gravis // J. Neuroimmunol. – 1998. – Vol. 81. – № 1. – P. 173-176.
Skeie G.O., Lunde P.K., Sejersted O.M., Mygland A., Aarli J.A., Gilhus N.E. Myasthenia gravis sera containing antiryanodine receptor antibodies inhibit binding of [3H]- ryanodine to sarcoplasmic reticulum // Muscle & Nerve. – 1998. – Vol. 21. – № 3. – P. 329-35.
Vicira M.L., Cailatt – Zucman S., Gajdos P. et al. Identification by genomic typing of non DR3 HLA class II genes associated with myasthenia gravis // J. Neuroimmunol. – 1993. – Vol. 47. – P. 115 – 122.
Vincent A. Neuroimmunology of Myasthenia Gravis // Brain. - Behavior and Immunity. – 1988. – Vol. 2. – P. 346-351.