Коррекция процессов пероксидации гепралом и милдронатом при экспериментальном перитоните

Б.Ф.Шевченко, Институт гастроэнтерологии АМН Украины, Днепропетровский национальный университет

В эксперименте на 138-ми белых крысах изучены особенности протекания полиорганной недостаточности и эндотоксикоза в различные фазы калового перитонита. Изучались антиоксидантные свойства гептрала (10 мг/кг массы внутрибрюшинно) и милдроната (50 мг/кг массы внутрибрюшинно) в условиях калового перитонита.
Оценку интенсивности перекисного окисления липидов и эндотоксикоза проводили по уровню накопления ТБК – связывающих соединений, содержанию продуктов диеновой конъюгации, восстановленного глутатиона в ткани печени, почек и сыворотке крови крыс. Изучалась активность ферментов антиоксидантной системы.

Показано, что назначение гептрала и милдроната позволяло стабилизировать процессы пероксидации, снизить явления эндотоксикоза, что выражалось в снижении содержания конечных и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, нормализации активности ферментов.

Ключевые слова: перитонит, милдронат, гептрал, глутатион.

Поскольку нерегулируемая активация перекисного окисления липидов рассматривается исследователями в качестве важного патогенетического звена в развитии многих, в том числе - воспалительно-деструктивных заболеваний, целью нашего исследования стало моделирование в эксперименте гнойного перитонита, изучение особенностей протекания полиорганной недостаточности и эндотоксикоза в различные фазы экспериментального калового перитонита.
Принимая в расчет важность изменений антиоксидантного статуса как одного из важнейших путей реализации летальных эффектов перитонита как острого гнойно-воспалительного заболевания, в настоящем экспериментальном исследовании предпринята попытка оценки влияния на течение заболевания терапии препаратами с выраженными метаболическими, в том числе - антиоксидантными свойствами - гептралом и милдронатом.

Гептрал - фармакопейный препарат S-аденозил-L-метионина - активного эндогенного метаболита, принимающего участие в промежуточном обмене огромного количества физиологически важных соединений, непосредственного предшественника в синтезе цистеина, таурина, и глутатиона.

Схема метаболизма in vivo S-аденозил-L-метионина представлена на рис.1

Рис. 1.Связь адеметионина с оборотом глутатиона.

Милдронат – фармакопейный препарат - бутеробетаина, одного из физиологических ингибиторов синтеза карнитина – предшественника ацетил-коэнзима А. В условиях гипоксии милдронат оптимизирует энергетический потенциал клетки, усиливая гликолитическую продукцию АТФ.

Материалы и методы. Модель калового перитонита воспроизводилась на 138-ми белых крысах линии WISTAR. Каловый перитонит вызывали введением 10% каловой взвеси в дозе 1.5мл/300г массы животного.
Основная группа (N 1) (32 животных) получала милдронат внутрибрюшинно в дозе 50мг/кг массы животного, вторая группа (32 животных) получала гептрал в дозе 10 мг/кг массы животного внутрибрюшинно, третья группа (32 животных) получала и гептрал и милдронат в вышеуказанных дозах, контрольная группа (32 животных) получала внутрибрюшинно физиологический раствор. Группа интактных животных составила 10 белых крыс.
Животных забивали декапитацией на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е сутки после инфицирования брюшной полости, производили забор печени, почек, сыворотки крови для биохимических исследований.
Состояние про- и антиоксидантных систем органов и тканей животных оценивалось с помощью общепринятых биохимических методик: интенсивность ПОЛ в сыворотке крови, тканях печени и почек определялась на 1, 3, 5 и 7 сутки после развития перитонита по накоплению ТБК-связывающих соединений, а в ткани печени - и по содержанию продуктов диеновой конъюгации. Состояние антиоксидантной системы в печени в те же сроки оценивалось по содержанию восстановленной формы глутатиона, активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, глутатион-редуктазы и глутатион-пероксидазы.

Результаты. Как следует из данных таблицы, при развитии перитонита отмечается накопление в ткани печени продуктов липопероксидации, достигающее максимума на 3-и сутки заболевания. Так, содержание ТБК-СС в ткани печени крыс контрольной группы (не получавших лечение препаратами-антиоксидантами), в указанный срок более чем в 4.1 раза (p<0.001) превысило уровень интактных (52.45.8 нмоль/г ткани) животных. Наблюдавшееся к 5 и 7 суткам наблюдения снижение содержания ТБК-СС у пораженных животных не обеспечивало восстановления исходного уровня, превышение над значениями показателя в тканях интактных животных на 5 и 7 сутки исследования составило в 3.4 и 3.1 раза (оба – p<0.01) соответственно.
Динамика содержания ТБК-связывающих соединений (ТБК-СС) в ткани печени крыс с перитонитом показана в таблице 1.

Таблица 1.
Содержание ТБК-связывающих соединений в ткани печени крыс с перитонитом (нмоль/г ткани)

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем
** - p<0.01 по сравнению с контролем

Терапия как гептралом, так и милдронатом приводила к значительному снижению интенсивности процессов ПОЛ, что доказывается фактом статистически достоверно более низкого уровня ТБК-связывающих соединений в тканях печени крыс всех групп, получавших терапию указанными препаратами, в период с 3 по 7 сутки течения экспериментального перитонита, по сравнению с не леченным контролем. Необходимо при этом отметить приблизительно равную эффективность как одного из перечисленных антиоксидантных препаратов, так и их сочетания, что позволяет рекомендовать любой из них в качестве лекарственного средства патогенетической терапии в комплексе хирургических и фармакологических мер лечения перитонита.
Поскольку максимум накопления конечных продуктов пероксидации – ТБК-СС был отмечен на 3-и сутки эксперимента, мы постарались оценить начальные этапы активации процессов ПОЛ с использованием методики определения одного из классов промежуточных продуктов свободнорадикальных реакций – так называемых “диеновых конъюгатов” (ДК). Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2.
Содержание в ткани продуктов диеновой конъюгации в ткани
печени крыс с перитонитом (мкмоль/г ткани)

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем

Уже через сутки после инициации перитонита в ткани печени наблюдалось значительное – в 1.43 раза (p<0.05) повышение содержания ДК по сравнению с показателями интактных животных - 25.63.8 мкмоль/г ткани. Максимум же накопления ДК в ткани печени, как и в случае ТБК-СС, наблюдался к исходу 3-х суток эксперимента – в 1.75 раза (p<0.05). Таким образом, максимум накопления как промежуточных, так и конечных продуктов липопероксидации наблюдался на 3 сутки развития перитонита, т.е. в период наиболее тяжелого развития гнойно-деструктивных изменений в тканях брюшной полости.
Терапия перитонита милдронатом и гептралом способствовала снижению интенсивности образования ДК. Данный тезис доказывается фактом достоверного снижения при лечении препаратами с антиоксидантными свойствами по сравнению с нелеченным контролем содержания в ткани печени крыс ДК на 3-и сутки эксперимента: при терапии перитонита гептралом, милдронатом и при их сочетании содержание ДК оказалось сниженным соответственно на 24.6 %, 29.2 % и 28.8 % (все – p<0.05). При комплексной терапии милдронатом и гептралом и к исходу 5-х суток наблюдения отмечено статистически достоверное по сравнению с контролем снижение содержания ДК в ткани печени – на 30.0 % (p<0.05).
Для оценки состояния антиоксиднтной системы в первую очередь определялось содержание одного из эндогенных веществ с наиболее выраженными антиоксидантными свойствами – восстановленного глутатиона (табл. 3), а также основных ферментов, обеспечивающих его обмен: глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (табл. 4), глутатион-пероксидазы (табл. 5) и глутатион-редуктазы (табл. 6). Проводилась оценка содержания ТБК–СС в сыворотке крови и почках крыс (табл. 7, табл.8).
После инициации перитонита у экспериментальных животных отмечено снижение содержания восстановленного глутатиона в ткани печени – на 12.2 % (p<0.05) к исходу 1-х, и на 26.5 % (p<0.05) – к 3-м суткам наблюдения по сравнению с показателями интактных животных - 4.980.31 мкмоль/г ткани. При терапии перитонита гептралом и милдронатом во все сроки наблюдения отмечена тенденция к более высокому содержанию восстановленного глутатиона в тканях печени крыс, однако статистически достоверными являются только рост содержания ВГ на 3-и сутки наблюдения при лечении гептралом (на 22.4 %, p<0.05) и сочетанием гептрала и милдроната (на 18.9 %, p<0.05).

Таблица 3.
Содержание восстановленного глутатиона в ткани печени крыс с перитонитом (мкмоль/г ткани)

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем
** - p<0.01 по сравнению с контролем

Механизм поддержания более высокого уровня восстановленной формы глутатиона при терапии гептралом может быть связан как с индукцией синтеза этого важного эндогенного метаболита, так и с регулирующим действием на ферменты его обмена. Ведущим фактором, вероятно, является активация синтеза соединения, лимитируемая in vivo только дефицитом цистеина [2].
Развитие экспериментального перитонита у крыс приводило к росту активности в ткани печени одного из ключевых ферментов антиоксидантной защиты - глутатион-пероксидазы (табл.4). Так, уже через сутки после инициации перитонита в ткани печени нелеченных животных отмечен более чем 10-кратный рост активности фермента по сравнению с величинами интактных животных - 5.71.3 мкмоль/(г белка  мин) (p<0.001), а превышение нормальных величин через 3 суток наблюдения достигло почти 30-кратной отметки (p<0.001). Столь выраженный рост активности фермента может быть связан с высказанным в специальной литературе предположением о возможности активации фермента при накоплении в среде его субстратов, в первую очередь, гидроперекисей жирных кислот [4]. Данный тезис косвенно подтверждается нашим экспериментальным материалом, поскольку пик активности фермента приходится на период максимального накопления как промежуточных, так и конечных продуктов липопероксидации (3 сутки развития перитонита). С другой стороны, рост активности фермента может быть связан с несецифической “стресс-реализующей” реакцией организма на инициацию тяжелого гнойно-деструктивного заболевания, поскольку описан механизм активации как этого фермента (ГП), так и Г-6-ФДГ и глутатион S-трансферазы в ответ на стимулированный катехоламинами рост внутриклеточного содержания цАМФ [3].
Терапия перитонита милдронатом и гептралом компенсировала вызванные развитием гнойно-деструктивного состояния изменения активности фермента: во все сроки наблюдения и при применении всех указанных схем отмечено достоверное снижение активности по сравнению с показателями нелеченных животных. Подобные результаты также могут косвенно говорить о высокой эффективности использованных препаратов в купировании гиперактивации ПОЛ.

Таблица 4.
Динамика активности глутатион-пероксидазы в ткани печени крыс с перитонитом (мкмоль/(г белка  мин))

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем
** - p<0.01 по сравнению с контролем

В представленной в таблице 5 динамике активности в ткани печени Г-6-ФДГ, фермента, ответственного за восстановление основной биологически активной формы глутатиона (ВГ), необходимо отметить двухфазный характер изменений активности: почти 3-кратный рост активности фермента по сравнению с показателем интактных животных (42.98.7 мкмоль/(г белка  мин)) через 1 сутки после инициации перитонита (p<0.05), а затем – к 3-м суткам эксперимента – снижение активности почти в 8 раз по сравнению с показателем первого дня наблюдения (p<0.01) и более чем вдвое – по сравнению с интактным контролем (p<0.05).
Отмеченный начальный пик активности фермента при этом может быть связан со стресс-реакцией, в то время как столь выраженное снижение активности фермента на пике активации процессов ПОЛ – с эффектом угнетения фермента, являющегося типичным тиол-содержащим белком, под действием активных форм кислорода и продуктов липопероксидации [5, 8].
Терапия перитонита гептралом и милдронатом способствовала значительной стабилизации активности фермента. Так, при применении указанных препаратов в 1-е сутки наблюдения не было обнаружено роста активности Г-6-ФДГ по сравнению с показателями интактных животных и отмечено снижение по сравнению с показателями контроля в 3.2, 4.1 и 7.4 раза (все - p<0.05). Терапия как гептралом, так и милдронатом способствовала росту активности фермента в период максимальной активации процессов пероксидации, причем особый интерес представляет установленный факт активации под действием милдроната Г-6-ФДГ более чем в 10 раз (p<0.01). Терапевтическая активность препарата, таким образом, может быть следствием не только торможения процессов -окисления жирных кислот и активации гликолиза в тканях, подавления кетогенеза, но и активации пентозо-фосфатного шунта с повышенной наработкой пентоз и восстановленной формы НАДФ, необходимой для процессов детоксикации, антиоксидантной защиты и репарации.

Таблица 5.
Динамика активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы в ткани печени крыс с перитонитом (мкмоль/(г белка  мин))

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем
** - p<0.01 по сравнению с контролем

Таблица 6.
Динамика активности глутатион-редуктазы в ткани печени крыс с перитонитом (мкмоль/(г белка  мин))

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем
** - p<0.01 по сравнению с контролем

В таблице 7 представлены данные о динамике содержания ТБК-СС в ткани почек. Как показали данные наших исследований, к исходу 3-х суток наблюдения отмечается рост содержания конечных продуктов ПОЛ – в 2.3 раза (p<0.01) по сравнению с показателями интактных животных (34.84.7 мкмоль/г ткани), достоверно повышенный уровень сохранялся при этом до конца наблюдения.
При терапии перитонита с помощью гептрала и милдроната во все сроки исследования установлена тенденция к снижению образования ТБК-СС, достоверные различия при этом были установлены через 3 суток при терапии милдронатом – в 1.8 раза (p<0.05), через 5 суток при сочетанном применении обоих препаратов – в 2.2 раза (p<0.05), а также к исходу 7-х суток наблюдения при терапии по всем указанным схемам: в 2.0 (p<0.05), 2.3 (p<0.05) и 2.3 (p<0.05) раза при терапии гептралом, милдронатом и их сочетанием соответственно.

Таблица 7.
Содержание ТБК-связывающих соединений в ткани
почек крыс с перитонитом (мкмоль/г ткани)

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем

Динамика содержания ТБК-связывающих соединений в сыворотке крови экспериментальных животных при перитоните представлена в таблице 8. Уже через сутки после инициации перитонита в сыворотке крови лабораторных животных отмечено почти двухкратное повышение (p<0.05) содержания ТБК-СС по сравнению с интактным контролем (87.29.3 нмоль/л). Максимум содержания конечных продуктов пероксидации наблюдался через 3 дня, причем превышение содержания ТБК-СС составило 3.4 раза (p<0.05).

Таблица 8.
Содержание ТБК-связывающих соединений в сыворотке крови
крыс с перитонитом (нмоль/л)

Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем

Обсуждение. Интерес к восстановленному глутатиону в настоящем исследовании обусловлен тем, что это соединение на разных уровнях способно прерывать процессы, приводящие к активации ПОЛ, оно неферментативно связывает и утилизирует АФК - НО• [8], 1О2 [9], посредством ГП снижает уровень Н2О2 [3, 10], с помощью ГП и ГТ способствует утилизации перекисей жирных кислот и других биомолекул, включая перекиси нуклеотидов [11], на всех уровнях уменьшая количество свободных радикалов.
Ключевым ферментом, осуществляющим утилизацию активных форм кислорода и продуктов пероксидации, является Se-зависимая глутатион-пероксидаза (ГП), участвующая в двух линиях ферментативной защиты клеток от окислительного стресса [4]: во-первых, утилизации перекиси водорода, во-вторых, продуктов перекисного окисления липидов (гидроперекисей жирных кислот) и перекисей других веществ. В общем виде схема катализируемых ГП реакций может быть представлена следующим образом:

2ВГ + Н₂О₂ ® ОГ + 2Н₂О

2ВГ + ROOH ® ОГ + ROH + Н₂О
Таким образом, конечными продуктами реакций являются окисленный глутатион (ОГ) и вода, либо ОГ и спирт - производное жирной кислоты или другого подвергнутого пероксидации вещества, обычно не обладающий клеточной токсичностью. Необходимо отметить, что глутатион-пероксидазная реакция in vivo является основным путем образования окисленной формы глутатиона, имеющей высокую биологическую активность [3].

Восстановленный глутатион рассматривается в качестве основного компонента редокс-буфера клетки, устойчиво поддерживающего характерную для нее восстановленную среду [12]. Таким образом, выполнение ферментами системы глутатиона функций по поддержанию тиол-дисульфидного равновесия и антиоксидантной защиты во многом определяется возможностями клетки по быстрой наработке восстановленной формы глутатиона.

Скорость редокс-циклирования глутатиона [3], то есть НАДФ•Н-зависимого восстановления окисленной формы глутатиона до восстановленной под действием глутатион-редуктазы (ГР), намного превосходит возможности синтеза глутатиона в тканях [5]. Для осуществления данной реакции требуется присутствие в тканях высокого уровня НАДФ•Н. Так, в нормальных условиях в глутатион-редуктазной реакции расходуется в 6 раз больше НАДФ•Н, чем на биосинтез жирных кислот и микросомальные оксигеназы [6].
Единственным значимым источником восстановленной формы НАДФ является ключевая реакция пентозофосфатного пути метаболизма углеводов - глюкозо-6-фосфат дегидрогеназная (Г-6-ФДГ), которая и лимитирует возможности редокс-циклирования глутатиона в условиях, характеризующихся активацией процессов пероксидации [7].
Результаты исследования еще раз подтвердили, что система глутатиона играет важную роль в поддержании нормальной жизнедеятельности организма, обеспечивая многоуровневую и эффективную защиту клеток и тканей от повреждающего действия активных форм кислорода и продуктов пероксидации.
Определяющее значение системы глутатиона в этих процессах вызывает не ослабевающий поиск препаратов позволяющих эффективно коорректировать процессы пероксидации в условиях эндотоксикоза.
Таким образом, использование гептрала и милдроната вело к стабилизации системы глутатиона, снижению накопления токсичных продуктов перекисного окисления липидов, что позволяет эффективно корректировать процессы пероксидации в ткани печени в условиях экспериментального перитонита.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Meister A., Anderson M.E. Glutathione // Ann. Rev. Biochem.- 1983.- Vol.52.- P.711-760.
2. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона // Успехи биол. химии.- 1990.- Т.31.- С.157-179.
3. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи совр. биол.- 1990.- Т.110, Вып.1(4).- С.20-33.
4. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы // Успехи совр. биол.- 1993.- Т.113, Вып.1.- С.107-122.
5. De Almeida A.F., Curi R., Newsholme P., Newsholme E.A. Maximal activities of key enzymes of glutaminolysis, glycolysis, Krebs cycle and pentose-phosphate pathway of several tissues in mature and aged rats // Int. J. Biochem.- 1989.- Vol.21, № 8.- P.937-940.
6. Reed D.J. Regulation of reductive processes by glutathione // Biochem. Pharmacol.- 1986.- Vol.35, № 1.- P.7-13.
7. Giblin F.J., Schrimscher L., Chakrapani B., Reddy V.N. Exposure of rabbit lens to hyperbaric-oxigen in vitro: regional effects on GSH level // Invest. Ophtalmol. Visual Sci.- 1988.- Vol.29, № 8.- P.1312-1319.
8. Thompson J.E., Legge R.L., Barber R.F. Tansley review. 8. The role of free radicals in senescence and wounding // New Phytologist.- 1987.- Vol.105, № 3.- P.317-344.
9. Rougee M., Bensasson R.V., Lang E.J., Pariente R. Deactivation of singlet molecular oxigen and related compounds, possible protectors against skin photosensitivity // Photochem. Photobiol.- 1988.- Vol.47, № 4.- P.485-489.
10. Wendel A. Glutathione peroxidase // Enzymatic basis of detoxycation / Biochem. Pharmacol. Toxicol.: Ed by W.B.Jakoby.- Orlanto: Acad. Press, 1980.- Vol.1.- P.333-335.
11. Ketterer B., Meyer D.J. Glutathione transferase - a possible role in the detoxication and repair of DNA and lipid hydroperoxides // Mutat. Res.- 1989.- Vol.214, № 1.- P.33-40.
12. Ziegler D.M. Role of reversible oxidation-reduction of enzyme thiols-disulfides in metabolic regulation // Annual. Rev. Biochem.- 1985.- Vol.54.- P.305-329.