Электронно-лучевые технологии в фармакологии. Часть II.
На мировом фармацевтическом рынке композиционные средства для наружного применения занимают не менее 10% от общего объема производимых лекарственных препаратов. Для изготовления этих средств традиционно используются такие гидрофобные основы как вазелин, ланолин и растительные масла. Существенными недостатками гидрофобных мазевых основ являются: низкая газопроницаемость, приводящая при инфекционно-воспалительных процессах к развитию анаэробной микрофлоры, и несовместимость с большинством биологически-активных веществ. С использованием гидрофобных основ практически невозможно получить мазевые формы таких лекарственных препаратов как ферменты, так как последние проявляют свою активность лишь в водной среде, и присутствие в композиции гидрофобной основы может вызвать необратимую денатурацию и потерю специфической активности. Тем не менее, интерес к разработке мазевых форм лекарственных препаратов, содержащих ферменты, в частности, бактериальные протеиназы, постоянной растет. Такая тенденция связана с увеличением частоты гнойно-воспалительных процессов. Существующая в настоящее время лечебная тактика, основанная на использовании антибиотиков 4 и 5 поколения, позволяет лишь частично решить проблему гнойно-воспалительной патологии. Наиболее впечатляющие результаты достигаются при сочетании антибактериальной терапии с протеолитческими ферментами, которые осуществляют ферментативный лизис белков некротизированных тканей, являющихся питательной средой для развития патогенных микроорганизмов. Для создания мазей, содержащих в своем составе ферменты, гидрофильные гели на основе природных и синтетических полимеров являются наиболее приемлемой композиционной основой. Гели на основе агара, хитозана, карбоксиметилцеллюлозы и т.д. обладают высокой гидрофильностью, газопроницаемостью и практически не влияют на активность растворенных в них ферментов. К недостаткам гелей на основе биополимеров следует отнести их низкую устойчивость к микробной деградации. С нашей точки зрения органические полимеры, и, прежде всего полиэтилен оксиды, являются наиболее перспективными для изготовления гидрофильных гелей медицинского назначения. Как известно, полиэтилен оксид отличается чрезвычайно высокой химической инертностью, он практически не подвергается биодеградации и практически безвреден для организма человека. Основная проблема при получении гидрофильных гелей полиэтилен оксида заключается в отсутствии технологически простых и доступных способов “сшивания” молекул полимера с образованием 3-х мерной сетчатой структуры. Химические способы, основанные на использовании бифункциональных реагентов, сложны и требуют проведения тщательной очистки образовавшегося геля от токсичных примесей. Мы полагаем, что наиболее перспективен физико-химический способ получения гелей полиэтилен оксида из его водных растворов с использованием технологии радиационной “сшивки”.
В настоящее время известно, что при действии ионизирующего излучения на растворы некоторых полимеров происходит образование геля. Процесс радиационного гелеобразования характерен лишь для тех полимеров, у которых под действием ионизирующего излучения процессы сшивания преобладают над процессами деструкции. В целом направленность процесса радиолиза полимера в растворе и доза гелеобразования определяется как его свойствами, так и условиями облучения. К радиационно-сшивающимся полимерам относятся: поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полиакриламид. Для водных растворов полиэтилен оксидов установлено, что при облучении в присутствии кислорода они в основном подвергаются деструкции. При облучении в отсутствии кислорода полиэтилен оксиды способны сшиваться.
Как показали наши исследования, облучение ускоренными электронами растворов полиэтилен оксида с молекулярной массой 1500Да (далее сокращение ПЭО-1500) при мощностях дозы 5 кГр/с и выше позволяет получать гель без удаления растворенного кислорода. Доза гелеобразования зависит от концентрации раствора полиэтилен оксида и для растворов с концентрациями от 1% до 50% составляет от 40 до 420 КНР (Рис.24). Образующиеся гели представляют собой бесцветную стекловидную массу, гомогенизация которой позволяет получать текучие гели с динамической вязкостью от 3 до 6 Па/с в зависимости от концентрации раствора полиэтилен оксида. Разработанный нами способ получения геля защищен патентом России N 2026349 от 9.01.95 г.
Гель ПЭО-1500 с содержанием основного вещества 10% был использован нами для получения препарата “Стоматозим”, представляющего собой протеазу Bac.subtilis, иммобилизованную на полиэтилен оксиде и геле полиэтилен оксида.
Исследование термостабильности стоматозима в отсутствии субстрата показало, что препарат обладает высокой термостабильностью. Как видно из результатов исследования, представленных на Рис.2, стоматозим сохраняет 37% активности после прогревания препарата при 50°С в течение 24 часов.Стабилизирующий эффект геля полиэтилен оксида на протеазу, вероятно, связан с так называемым эффектом “двойной иммобилизации”, при которой иммобилизованный на полиэтилен оксиде фермент дополнительно связывается в результате действия ионизирующего излучения с образующейся пространственной сеткой геля полиэтилен оксида. При этом образующийся при облучении гель создает вокруг протеазы своеобразную оболочку, стабилизирующую фермент. Не исключено образование при этом и дополнительных химических связей между полиэтилен оксидом, на котором первоначально был иммобилизован фермент, и пространственной сеткой геля полиэтилен оксида.Такая двойная иммобилизация позволяет препарату достигнуть высокой конформационной стабилизации протеазы и, как следствие, пробрести устойчивость к денатурационному воздействию повышенной температуры и автолизу.
На основе технологии радиационной иммобилизации на первом этапе создания “Стоматозима” нами была получена также жидкая форма лекарственного препарата, содержащего иммобилизованные протеазы, получившая название “Имозимаза”, которая имеет самостоятельное медицинское применение.
Схематично процесс получения “Имозимазы” представлен на Рис.3. Смесь фермента и полиэтилен оксида в растворе подвергается воздействию потока ускоренных электронов (доза менее 20 кГр), при этом происходит активация полимерного носителя и его взаимодействие с протеазой с образованием иммобилизованной формы.В настоящее время протеаза Bac. subtilis, иммобилизованная на ПЭО-1500 радиационным методом, разрешена для медицинского применения и внесена в Государственный Реестр лекарственных средств России под официальным названием “Имозимаза”.
Клинические испытания имозимазы и ее последующее внедрение в практическое здравоохранение показали высокую терапевтическую эффективность препарата при лечении гнойно-воспалительной патологии различного происхождения. Основу фармакологического эффекта имозимазы составляет способность препарата вызывать ферментативный лизис (разрушение) белков некротизированных (омертвевших) тканей. Ферментативный некролизис ведет к сокращению первой фазы раневого процесса - очищению поверхности тканей, поврежденных патологическим процессом, от денатурированных белков. Ускорение очищения раневой поверхности от нежизнеспособных тканей способствует появлению грануляции в более ранние сроки и вызывает ускорение эпителизации.
С 1987 г., когда было получено разрешение Фармакологического Комитета на проведение клинических испытаний, до настоящего времени имозимаза апробирована во многих ведущих клиниках России. Наиболее широко имозимаза используется в хирургии, пульмонологии и стоматологии. В хирургической практике препарат применяется при лечении острых и хронических гнойно-некротических процессов различной этиологии и локализации: нагноившиеся послеоперационные раны, гнойные раны после вскрытия абсцессов и флегмон, первично инфицированные раны, ожоги и отморожения различной степени тяжести, длительно незаживающие раны, трофические и лучевые язвы, хронические остеомиелиты. В пульмонологии имозимаза применяется при лечении заболеваний, сопровождающихся выделением вязкой гнойной мокроты: острые и хронические трахеобронхиты, пневмонии, бронхоэктатическая болезнь, муковисцидоз и др. В ряде клинических ситуаций имозимаза высокоэффективна в качестве муколитического препарата для санации бронхов в предоперационном периоде с целью профилактики пост операционных обтурационных осложнений. В стоматологии имозимаза используется в комплексном лечении глубокого кариеса молочных и постоянных зубов, острых экссудативных пульпитов, воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта, острых и хронических периодонтитов, гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области.
Для демонстрации возможностей и эффективности “Имозимазы” ниже представлены три примера ее использования при клинической апробации этого препарата.
Имозимаза применялась в Клинике общей хирургии Тернопольского медицинского института в качестве местного протеолитического средства у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей и трофическими язвами. При применении препарата отмечался выраженный положительный клинический эффект, снижалась микробная обсемененность ран и фаза воспаления сокращалась на 2-3 дня в сравнении с традиционными способами лечения. Отмечен положительный эффект имозимазы при очищении трофических язв нижних конечностей, возникших на фоне посттромбофлебитического синдрома.
На кафедре терапевтической стоматологии Новосибирского медицинского института “Имозимаза” применялась при лечении больных с воспалительной патологией пародонта, сочетанной с инсулинозависимым сахарным диабетом. Следует отметить, что воспалительные процессы у больных сахарным диабетом протекают особенно тяжело в связи с выраженными трофическими нарушениями в тканях. В настоящее время практически отсутствуют методы коррекции воспалительного процесса у таких больных, что в большинстве клинических случаев ведет к генерализации патологического процесса. В клинике “Имозимаза” применялась для лечения 200 больных сахарным диабетом с патологией пародонта: 10% гингивит, 30,6% генерализованный пародонтит легкой формы, 33,3% генерализованный пародонтит средней степени тяжести и 26,3% пациентов с тяжелой формой генерализованного пародонтита. Учитывая патогенез основного заболевания, лечение всех больных проводили комбинированным способом с использованием на первых этапах лечения, до снятия острых воспалительных явлений, цинковой пасты, содержащей имозимазу, антибактериальный препарат (фуразолидон). На завершающих стадиях лечения использовали цинковую пасту с фуразолидоном и инсулином. В контрольной группе больных лечение проводилось пастой аналогичного состава без имозимазы.
Анализ клинических результатов показал, что местное применение пасты с имозимазой в сравнении с контрольной группой больных более выраженное положительное влияние на течение воспалительного процесса в тканях пародонта. Так, при гингивите после 1-2 сеансов лечения пастой с имозимазой исчезали все воспалительные явления: отек, гиперемия, значительно уменьшилась кровоточивость.
Использование имозимазы в комплексном лечении больных сахарным диабетом с патологией пародонта позволило сократить сроки местного лечения на 40% при гингивитах, на 29,5% при легких формах пародонтитов, на 33,3% при пародонтитах средней тяжести и 20% при тяжелых формах заболевания.
В лечении глубокого кариеса во всех клинических случаях был получен положительный эффект. Применение имозимазы и стоматозима позволило отказаться от машинной препаровки дна и стенок кариозной полости. Обработанный иммобилизованными протеазами нежизнеспособный дентин за счет ферментативного лизиса белков легко убирался зубным экскаватором, после чего зуб пломбировался по общепринятой методике. Лечение острых пульпитов проходило в два посещения. В третье посещение зубы пломбировались также по общепринятой методике. Уже однократное применение препаратов иммобилизованных протеаз быстро приводило к устранению болевого синдрома, что свидетельствовало о купировании воспалительного процесса в тканях пульпы зуба. Использование препаратов имозимаза и стоматозим в терапии обострившихся хронических периодонтитов позволило отказаться от применения других лекарственных средств и сократить сроки лечения до 3 - 4 дней вместо обычных 10 - 15 дней.
Обобщив результаты клинической апробации имозимазы и стоматозима, нами совместно с кафедрой детской стоматологии Новосибирского медицинского института выпущены в 1994 г. методические рекомендации для врачей - стоматологов "Применение иммобилизованных протеолитических ферментных препаратов ИМОЗИМАЗА и СТОМАТОЗИМ в стоматологической практике".
В Новосибирском филиале НПО “Фтизиопульмонология” при лечении имозимазой фибринозно-кавернозного туберкулеза легких в сочетании с хирургическими методами и специфической противотуберкулезной терапией. Введение имозимазы в полость каверны после кавернотомии позволяет очистить ее стенки от специфических гнойно-некротических масс, при этом грануляционная ткань начинает появляться уже на 2-3 день применения препарата, а к исходу 6-7 суток процесс грануляции завершается, одномоментно закрываются устья бронхиальных свищей, которые в последующем облитерируются. С помощью ингаляционного введения имозимазы, за счет снижения вязкости мокроты и лизиса стенок каверн, удалось разработать способ выявления микобактерий туберкулеза у абациллярных больных деструктивным туберкулезом легких, который позволяет скоррегировать антибактериальную терапию и решить вопрос о необходимости оперативного вмешательства.Кратко резюмируя результаты медико-биологических доклинических исследований и проведенной клинической апробации, можно сделать вывод о широком спектре терапевтической активности “Имозимазы” в сочетании с ее низкой токсичностью и гипоаллергогенностью. При этом экспериментально клинически подтверждены некролитические, противовоспалительные, дезинтоксиционные иммуностимулирующие и другие фармакологические свойства препарата.
Разработанная нами электронно-лучевая технология получения фармакологических препаратов является лишь началом создания серии принципиально новых лекарственных средств на основе радиационно-модифицированных биологически-активных веществ. Для всестороннего освоения этой новой технологии создается пилотное производство, которое будет являться базой для дальнейших работ, как по производству новых препаратов, так и по освоению их опытно-промышленного серийного выпуска.