Электронно-лучевые технологии в фармакологии.

Развитие фармакологии на рубеже столетий – это поиск принципиально новых форм получения лекарственных препаратов. Эпоха химического синтеза простых лекарственных средств уже прошла и сейчас фармацевтический рынок полностью насыщен синтетическими препаратами. Одним из популярных направлений развития фармакологии является получение сложных лекарственных композиций, содержащих биологически активные вещества (белки, ферменты, фрагменты генома и т.д.), в том числе полученных на основе технологии иммобилизации. При иммобилизации биологически активное вещество химически связывается с каким-либо полимерным носителем, что позволяет целенаправленно изменять биологические и фармакологические свойства препарата. Альтернативой химическим процессам иммобилизации в фармакологии могут служить электронно-лучевые технологии. Использование ионизирующего излучения позволяет активировать различные полимерные носители и иммобилизовать на них биологически активные вещества, изменяя целенаправленно их свойства.

Одним и примеров практической реализации электронно-лучевой технологии является противотуберкулезный препарат “Изодекс”, который разработан ИЦиГ СО РАН совместно с ИЯФ СО РАН.

Выбор проблемы создания нового противотуберкулезного препарата не случаен. Во всем мире интерес к разработке таких препаратов, особенно со стороны крупных фармацевтических фирм, постоянно растет. Это обусловлено эпидемиологическими аспектами заболеваемости туберкулезом. За последние 10 лет заболеваемость туберкулезом легких увеличилась в несколько раз и приняла характер эпидемии, а по развивающимся и экономически отсталым странам приобрела черты пандемии.

Современная биологическая и медицинская наука позволяет вычленить две основные причины развития такого драматичного сценария: высокая толерантность возбудителя туберкулеза к химиотерапии и отсутствие высокоэффективных противотуберкулезных препаратов.

Возбудитель туберкулеза – палочка Коха (латинское название Micobacterium tuberculosis) - относится к древнейшим микроорганизмам, эволюция которых насчитывает миллионы лет. В ходе эволюции эта бактерия приспособилась для внутриклеточного развития и является внутриклеточной инфекцией. К таким же инфекциям относятся заболевания, вызываемые простейшими - малярия, токсоплазмоз, микоплазмоз, уроплазмоз и хламидиоз. Все эти заболевания крайне сложны в лечении, несмотря на достаточно обширный арсенал противопаразитарных препаратов, с помощью которых иногда удается стабилизировать процесс распространения заболевания. Возбудитель может иметь сниженный уровень обмена веществ и развиваться крайне медленно, что делает его устойчивым к химиопрепартам. Микобактерии обладают прочной полисахаридной клеточной стенкой, которая при неблагоприятных внешних условиях может трансформироваться в многослойную, при этом бактерии становятся практически недоступными для действия антибиотиков (так называемые L-формы Micobacterium tuberculosis).

Попавшие в организм человека микобактерии подвергаются фагоцитозу – атаке фагоцитами, клетками иммунной системы, которые поглощают их. Однако микобактерии, попадавшие внутрь фагоцитов, сохраняют свою жизнедеятельность и не подвергаются лизису (разложению) под воздействием внутриклеточных ферментов фагоцитов. В результате сами фагоциты, стражи молекулярного эпидемиологического порядка в организме человека, становятся местом развития и размножения возбудителей туберкулёза Micobacterium tuberculosis.

ПАР кл - паренхиматозная клетка, Рез МФ – резидентный макрофаг, мкб – микобактерия, лиз – лизосома

Изображен начальный этап поглощения микобактерии фагоцитом и её внутриклеточного развития. Резидентный фагоцит – основной элемент иммунологической обороны нашего организма - захватывает микобактерии туберкулеза, однако при этом не происходит их “утилизация” ферментами, находящимися в лизосомах фагоцитов. Эта способность микобактерий выживать внутри фагоцитов дает им возможность использовать макрофаги как временное “жилище” для своего развития и размножения.

Особенно опасны специфические образования - гранулемы, представляющие собой гигантские скопления трансформированных в эпителиоидные клетки фагоцитов, которые “нафаршированы” живыми Micobacterium tuberculosis. На Рис. 2 показана зрелая туберкулёзная гранулёма. Это специфическое образование представлено многоядерными клетками иммунной системы, которые поглотили микобактерии туберкулеза, но не смогли их обезвредить. Организм человека пытается, оградить очаг опасной инфекции путем развития фиброза, то есть формирования прочной соединительно - тканной капсулы из коллагеновых волокон, производимых фибробластами.

КПЛ – клетка Пирогова-Лангханса, мбт – микобактерия туберкулеза, ЭПК – эпителиоидная клетка, ЛФ – лимфоцит, МОН – моноцит, МФ – макрофаг, ФБ – фибробласт

Туберкулезная гранулема – это классический биологический дремлющий вулкан. При определенных условиях ослабления иммунобиологической резистентности организма человека происходит спонтанная гибель эпителиоидных клеток туберкулезной гранулёмы, их гидролитический “взрыв” за счет выхода протеолитических ферментов из лизосом и “расплавление” гранулёмы с выходом большого количества микобактерий в кровоток. Часть циркулирующих в кровотоке Micobacterium tuberculosis вновь захватывается фагоцитами, и жизненный цикл развития возбудителя туберкулеза повторяется (происходит повторный виток инфицирования с захватом новых “территорий”). Несомненно, имеются и другие особенности Micobacterium tuberculosis, однако они играют второстепенную роль в развитии туберкулёза.

Следующей составляющей эпидемиологического неблагополучия по туберкулезу является достаточно узкий спектр высокоэффективных противотуберкулезных препаратов, выпускаемых предприятиями фарминдустрии. Не вдаваясь в детали описания существующих противотуберкулезных препаратов (к ним относятся рифампицин, стрептомицин, пиразинамид, ПАСК и т.д.), хотелось бы остановиться на гидразиде изоникотиновой кислоты (изониазиде, синтубазид) и его многочисленных производных (фтивазиде, салюзиде, метазиде). Изониазид является базовым антимикобактериальным препаратом 1 группы и входит во все базовые терапевтические схемы лечения туберкулеза. Этот препарат был создан в конце 50-х годов и до настоящего времени не существует более эффективного аналога, превосходящего его по спектру терапевтической активности. In vitro (в клеточных культурах) изониазид обладает высокой антимикобактериальной активностью, в то числе и на L-формы Micobacterium tuberculosis. Однако in vivo (в живом организме) изониазид значительно менее эффективен вследствие внутриклеточной локализации возбудителя. При поступлении изониазида в кровоток происходит гибель свободно-циркулирующих Micobacterium tuberculosis. В зону персистенции микобактерий – инфицированные фагоциты и эпителиоидные клетки гранулем - препарат поступает в незначительном количестве ввиду особенности фармакокинетики. Около 90 % вводимого изониазида элиминируется в течение 24 часов печенью и почками. Следует подчеркнуть, что быстрая элиминация препарата и низкий процент доставки туберкулостатика в инфекционный очаг обусловливает периодичность его введения для поддержания постоянной терапевтической концентрации в крови. Именно поэтому лечение туберкулеза занимает весьма продолжительное время (до 6 месяцев и более). К этому следует добавить, что изониазид, как и другие противотуберкулезные препараты, относится к высокотоксичным соединениям и лечение туберкулеза сопровождается токсическими осложнениями со стороны печени, почек и ЦНС. Очевидно, что терапия туберкулеза изониазидом была бы более эффективной и сопровождалась бы значительно меньшим процентом осложнений, если бы удалось придать этому препарату свойство селективно доставляться в инфицированные макрофаги.

В Новосибирске под руководством член-корр. РАМН, профессора Вячеслава Алексеевича Шкурупия в конце 80-х годов был развернут цикл научно-исследовательских работ по созданию нового противотуберкулезного препарата, обладающего способностью селективно доставляться в инфицированные Micobacterium tuberculosis фагоциты для проведения так называемой “адресной” терапии туберкулеза. В этой работе активное участие приняли коллектив исследователей из Новосибирской медицинской Академии и Новосибирского НИИ туберкулеза МЗ РФ. В качестве действующей основы разрабатываемого препарата был использован широко известный туберкулостатик – изониазид. Для придания изониазиду селективной фаготропности он был химическим способом связан с полисахаридной матрицей – декстраном. Проведенные исследования in vitro и in vivo показали, что препарат обладает не только высокой антимикобактериальной активностью, но и значительно менее токсичен, чем исходно взятый, свободный изониазид. Основными препятствиями на пути внедрения нового препарата в фармацевтическое промышленное производство были высокая стоимость и сложность химического синтеза, который включал более 10 стадий, в том числе таких низко технологичных с точки зрения фармацевтического промышленного производства, как многократное спиртовое осаждение и диализ.

Последовательность химических реакций при получении гидразида изоникотиновой кислоты (HIA) – изониазида, иммобилизованного на декстране химическим способом, показана на Рис. 3.

В ИЦиГ СО РАН в 90-х годах прошлого столетия уже был разработан лекарственный препарат имозимаза на основе метода радиационной “сшивки” ферментов с полимерным носителем. Появилась идея использовать преимущества радиационной технологии иммобилизации для создания перспективного комплекса декстрана с изониазидом, который мог бы стать новым противотуберкулезным препаратом.

Рис. 4. Схема радиационного синтеза гидразида изоникотиновой кислоты

Схема технологии радиационного синтеза гидразида изоникотиновой кислоты показана на Рис.4. Для радиационной активации декстрана используется пучок электронов, генерируемый мощным ускорителем электронов ИЛУ-6.

В результате проведенных исследований был создан препарат “Изодекс” - усовершенствованный аналог комплекса изониазида с декстраном, получаемого ранее методом химического синтеза. Препарат “Изодекс” представляет собой гизразид изоникотиновой кислоты (изониазид), иммобилизованный на радиационно-активированном декстране. Источником полисахаридной матрицы является декстран, входящий в состав широко известного плазмозамещающего раствора “Реополиглюкин”.

Очевидны технологические преимущества “Изодекса” перед его предшественником, полученным химическим путем, связанные с особенностями радиационной технологии активации декстрана (Рис. 3 и Рис. 4):

• Радиационная активация проходит в 1 стадию. В реакционную смесь не вводятся токсичные, агрессивные химические реагенты и поэтому активированный декстран не нуждается в сложных и дорогостоящих методах очистки;
• Радиационная активация декстрана может осуществляться в уже готовой лекарственной форме (например, готовые упакованные флаконы “Реополиглюкина”), при этом сохраняется стерильность готового продукта;
• Радиационная активация декстрана легко управляется энергетическими параметрами источника ионизирующего излучения и может быть легко адаптирована к существующим промышленным фармацевтическим линиям, использующим метод радиационной стерилизации;
• Иммобилизация изониазида на радиационно-активированном декстране осуществляется также в 1 стадию, при этом совмещаются процесс иммобилизации и стерилизации препарата (условия стандартного промышленного автоклавирования).

В связи с тем, что разработанная технология весьма пластична и позволяет регулировать степень иммобилизации изониазида на декстране, концептуально было определено, что готовая лекарственная форма должна содержать как иммобилизованный изониазид, так и свободный (примерно эквивалентное соотношение). Иммобилизованный на декстране изониазид обеспечивает “адресную” терапию туберкулеза внутри фагоцитов, поскольку декстран легко проникает внутрь фагоцитов (он участвует в обмене веществ фагоцитов), а свободный изониазид обеспечивает воздействие на циркулирующую в крови популяцию Micobacterium tuberculosis. Этим достигается комплексность терапевтического эффекта “Изодекса” и низкое повреждающее действие препарата на печень.

Рис 5. Маршруты свободного и имобилизованного изониазида и их токсическое воздействие на печень.

ИД – изониазид иммобилизованный; И – свободный изониазид, ГЕП – гепатоцит, мкб – микобактерия, мик –микросома, пин – пиносома, лиз – лизосома, ЭК – эндотелиальная клетк, КК – клетка Купфера

Биологические маршруты свободного изониазида и изониазида иммобилизованного на декстране показаны на Рис. 5. Обе формы изониазида, входящие в состав препарата “Изодекс”, обеспечивают комплексное терапевтическое действие на всех уровнях локализации микобактерий туберкулеза. Этим достигается низкая токсичность препарата для клеток печени – гепатоцитов.

В настоящее время детально отработана технология получения “Изодекса” и изучены его лечебные и токсикологические свойства на стандартной экспериментальной модели туберкулеза у мышей.

Как показали исследования фармакологического действия, “Изодекс” в сравнении со свободным изониазидом обладает более выраженным лечебным эффектом. Об этом свидетельствуют более низкие значения размеров зон некроза в гранулемах печени и большая скорость снижения численности специфических туберкулезных гранулем в печени подопытных животных, зараженных Micobacterium bovis.

На Рис.6 и Рис.7 приведены результаты морфометрических исследований печени у экспериментальных животных (мышей, заражённых зараженных Micobacterium bovis) в процессе лечения туберкулеза различными формами изониазида. Численность гранулём и размеры зон некроза в печени коррелируют с количеством живых микобактерий туберкулеза.

Приведённые на Рис.8 и Рис.9 динамики изменения площадей некрозов и дистрофий в печени в процессе лечения экспериментального туберкулеза у мышей свидетельствует о более низкой токсичности “Изодекса” в сравнении со свободным изониазидом.

Как видно из представленных результатов, изониазид обладает более выраженным повреждающим действием на паренхиму печени и в связи с этим лечение туберкулеза сопровождается значительным процентом некрозов и дистрофий в печени у мышей.

“Изодекс”, в отличие от свободного изониазида, обладает значительно меньшей гепатотоксичностью (токсическим действием на печень) и, соответственно, дает меньшую площадь некрозов и дистрофий в печени. Мы полагаем, что этот эффект связан с защитным действием декстрановой матрицы на клетки печени, и, вероятно, этот эффект распространяется и на свободную форму изониазида, присутствующую в “Изодексе”.

Более выраженный лечебный эффект “Изодекса” связан с комплексным воздействием на возбудителя заболевания. Иммобилизованная форма изониазида обеспечивает эффективное подавление внутриклеточной популяции микобактерий, а свободный изониазид обеспечивает действие на внеклеточную популяцию бактерий.

По технологической части уже завершены следующие работы:

• Отработаны технологические параметры радиационной активации декстрана;
• Исследован выход альдегидных групп в декстране в зависимости от радиационной нагрузки.

В результате выполнения этого этапа работ был определен оптимальный радиационный режим, необходимый для активации декстрана, который не оказывает существенного влияния на молекулярно-массовое распределение в облучаемом полисахариде. Как показали исследования, выход альдегидных групп в декстране пропорционален поглощённой дозе и он может быть существенно увеличен путем введения в облучаемый раствор небольших количеств перекиси водорода как сенсибилизатора радиационно-химического окисления органических веществ. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Исследована кинетика связывания изониазида с радиационно активированным декстраном. Методом ионообменной хроматографии было показано, что в реакцию с изониазидом вступает 50% альдегидных групп активированного декстрана. Наличие в конечном продукте 50% свободного изониазида с клинической точки зрения целесообразно, так как придает препарату комплексное терапевтическое действие. Комплекс изониазида с декстраном за счет специфических свойств матрицы обеспечивает внутриклеточную доставку для антимикобактериального воздействия на внутриклеточную популяцию возбудитель, а свободный изониазид обеспечивает антимикобактериальное воздействие на внеклеточную популяцию возбудителя.

Таблица 1

Заключение

Таким образом, радиационная технология с использованием пучка ускоренных электронов может рассматриваться как весьма перспективный метод в технологии получения новых пролонгированных противотуберкулезных препаратов. Полученные нами экспериментальные результаты свидетельствуют о высокой фармакологической эффективности и низкой токсичности изониазида, иммобилизованного на радиационно активированном декстране. Отработка технологии активации декстрана и иммобилизации изониазида на примере получения препарата “Изодекс” показала реальные преимущества радиационных технологий перед технологиями химического синтеза, а именно:

• радиационная технология полностью исключает применение высокотоксичных химических активирующих реагентов;
• в процессе радиационной активации декстрана не образуются токсичные примеси, и готовый продукт не нуждается в дорогостоящих и технологически сложных методах очистки;
• радиационная технология базируется на промышленных источниках ионизирующего излучения ускорителях электронов и стационарных гамма источниках. В связи с этим технология получения нового противотуберкулезного препарата может быть адаптирована к существующим промышленным фармацевтическим производственным схемам без дополнительных затрат и в короткие сроки;
• получаемый препарат имеет в несколько раз более низкую стоимость, чем его аналог, полученный методом химического синтеза.

Кроме того, процесс активации декстрановой матрицы и, соответственно, пришивка к нему изониазида может быть пластичным и управляемым не только за счет изменения режима облучения, но и за счет введения сенсибилизирующих добавок.

Несомненно, что разработанная технология представляет собой основу для развития новых фармацевтических направлений в лечении других инфекционных заболеваний. Наши результаты практически показали, как эффективно объединение ученых-исследователей, работающих в различных областях фундаментальной и прикладной науки. Именно на стыке научных дисциплин возможно развитие принципиально новых технологий, которые так необходимы в наш динамичный XXI век.