Сравнительный анализ информативности радиоиммунологического исследования и лазерной корреляционной спектроскопии при миастении и миастенических синдромах

ГлавнаяСтатьи докторуЗаболевания и травмы костно-мышечной системы → Сравнительный анализ информативности радиоиммунологического исследования и лазерной корреляционной спектроскопии при миастении и миастенических синдромах

Современные методы лабораторной диагностики позволяют определять содержание огромного количества веществ в биологических жидкостях организма и на основе полученных данных диагностировать соответствующие заболевания. Однако определение концентраций индивидуальных веществ не позволяет интерпретировать полученные результаты в плане интегральной оценки гомеостаза.

Использованный нами метод лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС), позволяющий определять размеры субклеточных частиц и соотношения между ними, оказался весьма эффективным для достижения этой цели [3]. В основе метода ЛКС лежит регистрация спектральных характеристик монохроматического когерентного излучения в результате светорассеяния при прохождении через дисперсную систему. Для полидисперсных систем методами спектрального анализа спектра рассеянного света рассчитываются функции распределения частиц по их размерам. Полученная при этом корреляционная функция обрабатывается методом регуляризации, который не требует знания априорной информации и использует удобное гистограммное представление данных.

Целью настоящей работы было сопоставить информативность традиционного подхода (радиоиммунологическое определение концентрации антител к ацетилхолиновому рецептору) с оценкой сдвигов метаболизма, выявляемых с помощью ЛКС при миастении и миастенических синдромах.

Материал и методы исследования

Обследовано 35 пациентов: 29 больных с аутоиммунной миастенией, 3 – с конгенитальными миастеническими синдромами и 3 - с миастеническим синдромом Ламберта-Итона. Диагноз миастении или миастенического синдрома основывался на результатах клинического и электромиографического исследований, а также данных фармакологического теста с введением прозерина или калимина-форте. Тяжесть клинических проявлений миастении оценивалась по шестибалльной шкале, где 0 – отсутствие симптомов болезни, а 5 – их максимальная выраженность.

Процедуру радиоиммунологического определения концентрации антител к ацетилхолиновому рецептору (АХР) проводили с помощью набора фирмы “DLD Diagnostika GmbH” (Германия). Образцы сыворотки хранили при –20оС. Перед анализом их размораживали, отбирали аликвоты по 5 мкл и помещали в пробирки. К пробам добавляли по 100 мкл 125I-рецептора ацетилхолина (удельная активность – 342 Сi/ммоль), 50 мкл антител к IgG человека, перемешивали и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Добавляли по 1 мл промывочного буфера, центрифугировали при 3000 g 20 мин, надосадочную жидкость удаляли декантацией. Полученный осадок ресуспендировали и повторяли процедуру промывки.

Определяли радиоактивность проб (“RackBeta”, LKB, Швеция) и вычисляли концентрацию антител по следующей формуле:

С = (cpmi – cpmn) x D x F,

где С – концентрация антител, нмоль/л
D – фактор, учитывающий дату изготовления набора – 1,98
F – фактор, учитывающий удельную активность метки – 0,38 х 10-3
cpmi – радиоактивность пробы, имп/мин
cpmn – радиоактивность негативного контроля, имп/мин.

При исследовании сыворотки крови методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) в конечном итоге регистрируется информация о субфракционном составе молекулярных, надмолекулярных и комплексных ингредиентов в интервале от 1 до 10000 нм. Преимущественно это белки, иммунные комплексы, нуклеопротеины. Основные физические принципы, комплекс используемой аппаратуры и математическая обработка спектров изложены в недавно вышедшей монографии [3].

Образцы сыворотки размораживали, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин, отбирали 200 мкл надосадочной жидкости и помещали в измерительную кювету спектрометра «ЛКС-03» («Интокс», Россия). С помощью специально разработанной программы регуляризации интегральный спектр флуктуации интенсивностей рассеянного света пересчитывали в гистограмму, представляющую собой распределение частиц разного размера по их вкладу в суммарный эффект интенсивности светорассеяния. Для удобства истолкования полученных результатов весь интервал размеров частиц разбили на 5 дискретных зон: I - 0-10 нм – преимущественно низкомолекулярные мономерные белки и продукты их гидролиза; II – 11-30 нм – глобулярные белки и липопротеины; III – 31-70 нм – высокомолекулярные липопротеины и нуклеопротеины; IV – 71-150 нм – иммунные комплексы среднего размера; V – более 150 нм – высокомолекулярные иммунные комплексы.

Результаты

Результаты радиоиммунологического исследования концентрации антител к АХР в сыворотке крови больных представлены на рис. 1. Как следует из приведенных данных, из 18 исследованных образцов сыворотки больных миастенией, в 16 было обнаружено повышенное (более 0,12 нмоль/л) содержание антител.

Уровень антител к АХР не коррелировал с полом, возрастом, длительностью и тяжестью заболевания, фактором наличия сопутствующей тимомы. Так, максимальные значения (0,440 и 0,430 нмоль/л) выявлены у больной с минимальными клиническими проявлениями болезни и пациентки с выраженной слабостью мышц туловища и конечностей, соответственно. Минимальные величины (0,126 и 0,131 нмоль/л) обнаружены у больного с генерализованной формой миастении средней тяжести и пациентки в стадии ремиссии, у которой миастения сочеталась с тимомой.

Только у одного из трех пациентов с миастеническим синдромом Ламберта-Итона выявлено увеличение концентрации антител до 0,32 нмоль/л, тогда как у остальных этот показатель находился в пределах нормальных значений. Известно, что в случаях сочетания миастенического синдрома Ламберта-Итона и миастении возможно обнаружение антител к АХР в определенные периоды течения заболевания [10].

Клинический анализ больного с миастеническим синдромом Ламберта-Итона и повышенным содержанием антител к АХР показал наличие несомненнных клинических и электрофизиологических проявлений миастенического синдрома, наряду с признаками миастении (бульбарные и дыхательные расстройства). У двух из трех больных с конгенитальным миастеническим синдромом титр антител также превышал нормальные значения, что может свидетельствовать об ошибочности наших предположений о конгенитальной природе болезни.

Отсутствие корреляции между содержанием антител к АХР и тяжестью заболевания обусловило попытку выявить коррелятивные связи на интегративном уровне метаболических сдвигов с помощью лазерной корреляционной спектроскопии. Результаты приведены на рис. 2. Прежде всего, следует отметить, что все приведенные распределения отличаются от гистограммы здоровой популяции (Рис.2А). Для удобства больные миастенией со степенью выраженности 1 и 2 объединены в “легкую” группу, а 3 и 4 – в “тяжелую”. Видно, что у больных с легкими степенями возрастает вклад в светорассеяние частиц второй фракции (37% по сравнению с 10% в норме) (Рис.2Б). В то же время спектры больных “тяжелой” группы характеризуются некоторым возрастанием аутоиммунной компоненты при сохранении значительного вклада в светорассеяние второй фракции (Рис.2В). Наибольшее возрастание аутоиммунных комплексов (до 36%) отмечается у больных синдромом Ламберта-Итона (Рис.2Г), тогда как группа конгенитального миастенического синдрома (Рис.2Д) характеризуется резким возрастанием вклада сверхнизкомолекулярных компонентов (до 26% по сравнению с 10% в норме).

Обсуждение

Увеличение титра антител к АХР, наряду с клиническими проявлениями болезни, положительной реакцией на введение антихолинэстеразных препаратов и электромиографическими феноменами, отражающими нарушения нервно-мышечной передачи, являются классическими критериями диагностики аутоиммунной миастении [4, 6, 9]. Вместе с тем, большинство авторов подчеркивает отсутствие корреляции между титром антител к АХР и тяжестью клинических проявлений миастении [4, 8, 11, 12].

Выделены отдельная группа больных (около 20%), у которых значения титра антител не превышают величины этого показателя у здоровых лиц – серонегативная миастения [11]. Антитела к АХР, как правило, не выявляются у больных миастеническим синдромом Ламберта-Итона и конгенитальными миастеническими синдромами [5, 7, 9]. С другой стороны, повышение концентрации антител к АХР отмечали при циррозе печени, синдроме Хасимото и ревматоидном артрите [4]. Учитывая эти факты, можно объяснить как повышенное содержание антител к АХР у подавляющего большинства обследованных нами пациентов, так и отсутствие корреляции между концентрацией антител и тяжестью заболевания. Видимо, стандартный набор клинических, электрофизиологических и фармакологических тестов для миастении и миастенических синдромов должен быть дополнен таким анализом, который позволил бы выявлять биохимические корреляты тяжести процесса.

Весьма перспективным в этом плане представляется метод лазерной корреляционной спектроскопии. Из приведенных выше данных видно, что он позволяет не только оценивать тяжесть процесса, но и, при условии увеличения выборки, проводить дифференциальную диагностику миастении и миастенических синдромов. Имеется положительный опыт применения метода ЛКС для оценки эффективности гемосорбции при миастении [2]. Выявленное нами повышение содержания компонентов зоны 11-30нм (преимущественно иммуноглобулины), возможно, имеет регуляторное значение. В клинике иммуноглобулины, подавляющие в высоких дозах иммунные процессы, применяют для лечения миастении как альтернативу плазмафорезу. Можно предположить, что резкое повышение содержания иммуноглобулиновой фракции у больных с легкими стадиями заболевания является регуляторной реакцией, обеспечивающей снижение наработки аутоантител. В то же время, наблюдаемое у пациентов с тяжелым течением миастении уменьшение вклада этой фракции с одновременным нарастанием количества иммунных комплексов свидетельствует о недостаточности саногенетических механизмов и, следовательно, дальнейшем развитии дизрегуляционной патологии [1]. Можно предположить, что тяжесть болезни определяется количеством циркулирующих иммунных комплексов (V фракция).
Полученные данные дают основания полагать, что метод ЛКС может дополнить существующий арсенал диагностических средств, применяемых для оценки тяжести заболевания и эффективности лечения.

dus 3 edan цена

АПТЕКА ИФК

Пластика живота хирург